使用HISAT StringTie和Ballgown进行的转录本表达水平分析（中译）(三)

材料

配置

• 数据（本方案中使用的RNA-seq reads、索引和基因注释的例子可在链接；详情见设备设置）
• HISAT2软件（链接1或链接2），2.0.1或更高版本
• StringTie软件(链接1或链接2, 1.2.2 或更高版本)
• SAMtools （链接, 版本0.1.19或更高)
• R（链接，版本3.2.2或更高）。
• 硬件（64位计算机，运行Linux或Mac OS X（10.7 Lion或更高版本）；4GB内存（最好是8GB）；见设备设置)

设备配置

所需的数据

该协议用一个来自智人X染色体的例子实验来说明，你可以通过分析来熟悉全套软件。你需要的所有数据都可以在文件chrX_data.tar.gz中找到，该文件将在下面说明。要使用HISAT2和StringTie进行基因表达分析，你必须使用一个基因组已被测序的生物体。这两个工具也可以使用基因和转录物的注释文件，尽管这是可选的。HISAT2需要一个基因组的索引，这在数据下载文件中提供。在HISAT2网站上可以找到其他多个物种的预建索引。在没有可用索引的情况下，Box2提供了如何创建一个HISAT2索引的说明。

重要提醒 协议中使用的命令都应该从Unix shell提示下的终端窗口运行，直到在R环境中进行差异表达式分析。我们鼓励用户创建一个单一的目录（例如，“my_rnaseq_exp”），在其中存储所有的例子数据和分析所创建的文件。所有的命令都是在假设用户是在这个目录下工作的情况下描述的。该协议还包括在R统计计算环境中运行的小部分代码。拟在Unix shell（如bash或csh）中执行的命令以"$“字符为前缀。要从R脚本或R交互式shell中运行的命令前缀为”>“字符。

• Box2 | 创建HISAT2索引文件

  人类基因组和许多模式生物的预建HISAT2索引可以从HISAT网站下载。如果所需的索引不在那里，用户可能需要建立一个自定义的索引。这里我们描述了如何为人类X号染色体建立索引；要为其他基因组建立索引，应该用对应于该基因组及其注释的文件分别替换基因组文件CHRX.FA和注释文件CHRX.gtf。 首先，使用HISAT2软件包中的python脚本，从基因注释文件中提取剪接位点和外显子信息(Line:01,02)，然后再创建一个索引。

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  $ extract_splice_sites.py chrX_data/genes/chrX.gtf >chrX.ss $ extract_exons.py chrX_data/genes/chrX.gtf >chrX.exon $ hisat2-build --ss chrX.ss --exon chrX.exon chrX_data/genome/chrX.fa chrX_tran

  如果没有注释，上述命令中的–ss和–exon选项可以省略。请注意，建立索引的步骤比对齐步骤需要更多的内存，而且可能无法在台式电脑上执行。例如，为X染色体建立索引需要9GB内存，为整个人类基因组建立索引需要160GB内存。如果省略注释信息，内存量要小得多。使用一个CPU核心对X染色体进行索引 需要<10分钟。使用8个CPU核为整个人类基因组建立索引应该需要2小时。

下载和整理所需数据

解压数据文件并检查内容

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$ tar xvzf chrX_data.tar.gz

假设我们将数据存储在my_rnaseq_exp/，软件包解压后包含一个chrX_data/文件夹，其结构如下：samples/ indexes/ genome/ genes/（包含四个目录）。

样本目录包含12个样本的成对端RNA-seq reads(paired-end RNA-seq reads)，其中6个样本来自两个人群，GBR（来自英格兰的英国人）和YRI（来自尼日利亚伊巴丹的约鲁巴人）。每个人群都有三个样本，分别来自男性和女性受试者（每个样本的人口和性别见Table2）。

• Table2|协议中使用的样本

  样本ID	性别	人群
  ERR188245	Female	GBR
  ERR188428	Female	GBR
  ERR188337	Female	GBR
  ERR188401	Male	GBR
  ERR188257	Male	GBR
  ERR188383	Male	GBR
  ERR204916	Female	YRI
  ERR188234	Female	YRI
  ERR188273	Female	YRI
  ERR188454	Male	YRI
  ERR188104	Male	YRI
  ERR188044	Male	YRI

所有的序列都是压缩的’fastq’格式，它将每个read存储为四行。每个样本依次包含在两个文件中：一个是read 1，另一个是read 2。因此，例如，样本ERR188245包含在文件ERR188245_ chrX_1.fastq.gz和ERR188245_chrX_2.fastq.gz中，每个文件包含 855,983条reads。请注意，原始数据文件包含映射到整个基因组的reads，而不仅仅是X染色体，这些文件大约要大25倍。如果读者有兴趣，可以在链接下的README文件查看关于下载完整数据集的说明。请注意，HISAT2还提供了一个选项，称为-sra-acc，可以通过互联网直接使用NCBI序列阅读档案（SRA）数据。这消除了手动下载SRA reads并将其转换为fasta/fastq格式的需要，却不会显著影响到运行时间。例如，下面的HISAT2命令将下载并对齐本协议中使用的12个样本中的1个（ERR188245）。

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$ hisat2 -p 8 --dta -x chrX_data/indexes/chrX_tran --sra-acc ERR188245 –S ERR188245_chrX.sam

indexes目录包含X染色体的HISAT2索引，包括chrX_tran.1.ht2, chrX_tran.2.ht2, chrX_tran.3.ht2, chrX_tran.4.ht2 chrX_tran.5.ht2, chrX_tran.6.ht2, chrX_tran.7.ht2 和 chrX_tran.8.ht2.

基因组目录包含一个文件chrX.fa，它是人类X染色体的序列（GRCh38 build 81）。注意，如果你使用的是全基因组，这个目录将有一个包含所有染色体的文件。基因目录包含一个 chrX.gtf，它存储你了来自RefSeq数据库的GRCh38的人类基因注释。 chrX_data目录还包含另外两个文件：mergelist.txt和geuvadis_phenodata.csv。这些文件是运行这个协议必须的文本文件，如下文所述。通常情况下，你会自己用文本编辑器创建这些文件，但我们在这里提供它们作为例子。

下载安装软件

先创建一个目录来存储本协议中使用的所有的程序（如果还没有）

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$ mkdir $HOME/bin

将上述目录添加到你的PATH环境变量中

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$ export PATH=$HOME/bin:$PATH

要安装SAMtools，请从链接下载，解压SAMtools tar文件，然后cd到SAMtools源目录（该协议将适用于从0.1.19开始的所有SAMtools版本）。

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$ tar jxvf samtools-0.1.19.tar.bz2
$ cd samtools-0.1.19
$ make
$ cd .
// Copy the samtools binary to a directory in your PATH:
$ cp samtools-0.1.19/samtools $HOME/bin

要安装HISAT2，请从链接1或链接2，下载最新的二进制程序包，解压HISAT2的压缩包，并cd到解压后的目录。

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$ unzip hisat2-2.0.1-beta-OSX_x86_64.zip

接下来，将HISAT2的可执行文件复制到你的PATH中的一个目录。

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$ cp hisat2-2.0.1-beta/hisat2* hisat2-2.0.1-beta/*.py $HOME/bin

要安装StringTie，请从链接，下载最新的二进制包，解压StringTie tar文件，然后cd到解压后的目录。

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$ tar xvzf stringtie-1.2.2.OSX_x86_64.tar.gz

(注意，这个指令使用了Mac OS X的可执行文件。如果你使用的是Linux，可以用这个可执行文件代替：stringtie-1.2.2.Linux_x86_64.tar.gz）。接下来，将StringTie包的可执行文件复制到你的PATH中的某个目录。

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$ cp stringtie-1.2.2.OSX_x86_64/stringtie $HOME/bin

StringTie也可以从链接下载。要安装gffcompare，请从以下网站下载最新的二进制软件包链接，并按照 README.md文件中的说明。要安装Ballgown，请先启动R语言会话界面。

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$ R
R version 3.2.2 (2015-08-14) -- "Fire Safety"
Copyright (C) 2015 The R Foundation for
Statistical Computing
Platform: x86_64-apple-darwin13.4.0 (64-bit)

‘>‘前的文本为R的介绍信息结束。安装 Ballgown软件包和其他R的依赖项，如下所示。

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>install.packages("devtools",repos="http://cran.us.r-project.org")
>source("http://www.bioconductor.org/biocLite.R")
>biocLite(c("alyssafrazee/RSkittleBrewer","ballgown","genefilter","dplyr","devtools"))

运行本协议需要Bioconductor 3.0或更高版本，以及R 3.1版本。补充软件包括一个shell脚本和其他依赖文件，可以用来运行本协议的所有步骤。还包括一个README文件，解释了如何运行该脚本。这些文件也可以从链接获取。